宁波欧曼生物科技有限公司
摘 要:从人横纹肌肉瘤（RD）细胞株中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶 (BamH,Sma)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体. 将该基因插入含１＿７启动子的质粒ｐＥＴ一３２ａ 中构建表达质粒ｐＥＴ—ｓｏｄ，然后将该表达质粒转入大肠杆菌ＢＩ２１中进行蛋白表达，表达菌株用ｌｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导表达数小时后，产生较多重组的蛋白，且该蛋白以可溶性蛋白形式存在．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明：在相对分子量约为２２ｋｄ的位置有一条明显蛋白质带．将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行.
关键词:超氧化物歧化酶;基因重组;表达;纯化
细胞在生命过程中经新陈代谢产生多种自由基,如超氧阴离子自由基(O- )、羟基自由基(OH )、脂自由基(ROO )、二氧化氮和一氧化氮自由基,加上过氧化氢、单线态氧和臭氧,通称活性氧(ROS).体内活性氧自由基参与免疫和信号传导过程.但过多的活性氧自由基有破坏行为,导致人体正常细胞和组织的损坏,从而引起多种疾病,如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等.生存在富氧环境中的需氧生物进化出了可清除过量氧自由基的防御体系,其中的超氧化物歧化酶是清除氧自由基特别是超氧阴离子的第一道也是最重要的一道防线[1].超氧化物歧化酶于1969年由McCord和Fridovich从牛血红细胞中发现并提取,确定其具有酶活性,命名为SuperoxideDismutase,简称SOD[2].SOD广泛分布于生物体内,是一类金属酶,在抗氧化防御中发挥重要的作用.根据辅基结合的金属离子的不同,SOD可分为3类:CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD.CuZn-SOD存在于真核细胞细胞浆和某些原核细胞中,Mn-SOD存在于原核细胞和真核细胞线粒体中,FeSOD存在于原核细胞和一些高等植物细胞中[3].在人体中,超氧化物歧化酶也含有三类:SOD1定位于细胞质中;SOD2位于线粒体;SOD3则位于细胞外.SOD1和SOD3的活性位点含有铜和锌,而SOD2则含有锰.它们的基因分别定位于21号、6号和4号染色体[3].
SOD的主要功能是催化超氧阴离子自由基(O- 歧化为O 和HO(2O-+2H+ O+HO),具有重要的生理学作用.
1.1 材料
TripureIsolationReagent购自Roche公司,M-MLVRTasecDNASynthesisKit为TaKaRa公司产品, 质粒DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司,GlutathioneSepharose4B购自GE公司,异丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司,表达质粒pGEX-4T-2和大肠杆菌DH5 菌株由本实验室保存, TaqDNA聚合酶、dNTP、Sma 酶、BamH 酶、T4DNA连接酶、蛋白质标准marker购自Ferments,DNAmarker购自上海生工,其他试剂均为国产分析纯.
１．1．１ 引物合成及ＰＣＲ扩增
上游弓Ｊ物（５ ～３ ）…ATTGAATTCATGGCGACGAAGGCC…
ＢａｍＨＩ
下游弓ｌ物（５ ～３ ）…ATTGGATCCTTATTGGGCGATTCC…
ＳａｌＩ
反应体系为５０ｕｌ，ＰＣＲ反应条件：９４￣Ｃ预变性５ ｍｉｎ，一个循环；９４￣Ｃ变性１ ｍｉｎ，５６￣Ｃ退火１ ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ ｍｉｎ，３５个循环．
1.2 方法
1.2.1 人横纹肌肉瘤（RD）细胞株RNA的提取 取1个6cm培养皿人人横纹肌肉瘤（RD）细胞株细胞,用移液器吸去培养基,加入1mL的Tripure,吹打几次后转入1.5mL的Eppendorf管中.加入200 L氯仿,剧烈振荡混匀30s,4 下12000r/min离心10min.将上清液转移到RNase-free离心管里,加入等体积的异丙醇,室温下放置5min,4 下12000r/min离心12min,小心移去上清液,防止RNA丢失,用70%酒精洗涤两次,每次700 L,12000r/min离心2min,小心吸去上清液.沉淀在室温下放置3~5min,使酒精完全挥发,然后用30~50 L的DEPC-H2O溶解.
1.2.2 总RNA的逆转录 将4 g总RNA与Oligo(dT)18Primer(1 g/ L) 1 L放入RNase-free的Eppendolf管中,75 变性5min,立即冰浴,随后加入:5 逆转录酶缓冲液4 L,10mM的4种dNTPs混合液2 L,M-MLVReverseTranscriptase1 L,RNaseInhibitor(20U/ L) 2 L.加水补足至20 L,25 反应10min,42 反应30min后,70 加热15min终止反应.
1.2.3 SOD基因的重组表达 在20 LPCR反应体系中加入:10 TaqBuffer(含Mg2+) 2 L,dNTPs1 L,基因特异性引物1为10nmol,基因特异性引物2为10nmol,Taq酶0.5U,cDNA模板1 L,补水至20 L.实验同时设置阴性对照,在PCR扩增仪中进行反应,反应条件为:94 预变性3min,94 变性1min,58 退火30s,72 延伸30s,进行38个循环后72 延伸10min.PCR产物经常规方法电泳、切胶回收、双酶切(SmaI,BamHI)、连接、转化、菌落PCR初筛重组子,双酶切鉴定后挑选阳性克隆送上海生工测序部测序.
测序验证插入片段的序列正确后,挑取含有重组质粒的单菌落于5mLLB液体培养基(含氨苄青霉素100 g/mL),37 摇培过夜.按1 100的比例吸取菌液于新的5mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100g/mL),37 摇培至OD600为0.6左右时加入异丙基--D-硫代半苷(IPTG)至终浓度0.25mmol/L,37 继续摇培4~6h.诱导表达的菌液于5000r/min离心5min收集菌体,加入冰冷的1mL1 PBS缓冲液,冰浴条件下超声裂解细菌(150W 1 s 50次),间隔2 s. 4 下10000 g离心10min后上清与沉淀分别与SDS-PAGEloadingbuffer混合,SDS-PAGE电泳确定重组蛋白是否表达以及表达的蛋白质是否形成包涵体.1.2.4 SOD重组蛋白的纯化 按1 100的比例吸取菌液于新的250mLLB液体培养基(含氨苄青霉素100g/mL),37 摇培至OD600为0.6左右时加入异丙基--D-硫代半苷(IPTG)至终浓度0.25mmol/L,37 继续摇培4~6h.诱导表达的菌液于5000r/min离心5min收集菌体,加入冰冷的15mL1 PBS缓冲液,冰浴条件下超声裂解细菌(150W 10s 10次),间隔10s. 4 下10000 g离心20min后上清与预先用1 PBS缓冲液平衡的GlutathioneSepharose4B混匀,4 轻摇30min,装柱.用5~10个柱床体积的洗涤缓冲液(1PBS)洗去杂蛋白,至流出液的OD280接近于零后用洗脱缓冲液(50mmol/LTris-HCl,10mmol/L还原型谷胱甘肽,pH为8.0)洗脱目的蛋白.SDS-PAGE鉴定纯化的融合蛋白.
１．２．２人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中表达质粒的构建和转化
将人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶基因片段用ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ双酶切，回收片段，与预先经双ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ双酶切的ｐＥＴ一３２ａ ’回收片段相连接，构建大肠杆菌表达质粒ｐＥＴ—ｓｏｄ．将此表达质粒转人大肠杆菌ＢＬ２１中．经含有Ａｍｐ（１００ｕｇ／Ｌ）抗性的培养基筛选表达质粒．
１．２．３人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化
挑取单克隆在ＬＢ培养基含Ａｍｐ（１００ｕｇ／Ｌ）中，３７￣Ｃ下培养至ＯＤ６００＝０．４～０．６，加入终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ｈ后收集菌液，将收集的菌用Ｔｒｉｓ—Ｃ１（ｐＨ ７．４）洗３～４次，超声破碎．将破碎后的菌以１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，分别取破碎后的全菌、上清和沉淀ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析．蛋白纯化按照Ｎｏ—ｖａｇｅｎ公司的Ｎｉ—ＮＴＡ Ｈｉｓ．Ｂｉｎｄ
Ｒｅｓｉｎｓ的操作说明书进行：将蛋白过事先准备好的Ｎｉ Ａｇｒｏｓｅ柱，静置３０～４０ ｍｉｎ，后用２０ ｍｍｏＬ／Ｌ咪唑洗脱杂蛋白，用２５０ ｍｍｏＬ／Ｌ的咪唑缓冲液洗脱结合蛋白．
１．２．４ 酶活性测定和蛋白含量测定
酶活性测定用ＮＢＴ光还原法 ．
ＳＯＤ活性＝２（ＯＤ５６ｏ对照一ＯＤ５６ｏ处理）×稀释倍数／ＯＤ５６ｏ空白．
酶比活力（Ｕ／ｍｇ）＝ＳＯＤ酶液活性（Ｕ／Ｈｄ）／酶液蛋白含量（ｍｇ／ｍ１）．
蛋白质含量的测定；ｈ－Ｎ：将纯化后的蛋白稀释一定倍数后至３００ 试管内，再加入考马斯亮蓝Ｇ一２５０２．７Ⅱ１Ｌ混匀，室温下静置２ ｍｉｎ，钡０其５９５ ｎｌｎ下的吸光度，根据牛血清蛋白标准曲线计算其蛋白含量．
２ 结果与分析 １ ２ ３２．１人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶基因的克隆
将以人横纹肌肉瘤（RD）细胞株总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增的产物经１０ Ｌ琼脂糖凝胶电泳鉴定，可得到一条长与预期大小相符的ＤＮＡ扩增片段（图１）．将ＰＣＲ产物双酶切回收后由Ｔ４连接酶与ｐＵＣ一１９相连后进行序列测定．测序结果如图２，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为NM_000454
．
２．２人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达载体的鉴定 ７５０ｂ
克隆在ｐＵＣ一１９的基因片段用Ｂ啪ＨＴ及ＳａｌＩ双酶切，回收片段， 并与事先经ＢａｍＨＩ及ＳａｌＩ双酶切的ｐＥＴ一３２ａ ’相连接，构建表达质粒ｐＥＴ—ｓｏｄ，酶切鉴定结果如图３． ２．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；
２．３人横纹肌肉瘤（RD）细胞株超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达 ・Ａｍｐ ｉｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ・ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明，在相对分子量约为２２ ｋＤａ的位置上有一 图 ０Ｄ基因的ＰｃＲ扩增条明显的表达条带（图４），表明蛋白以可溶性蛋白存在上清中．
２．４ 表达产物的纯化和活性测定
经ＩＰＴＧ诱导表达的大肠杆菌菌体，冰浴下经超声破碎、Ｎｉ。 亲和纯化后，利用ＮＢＴ光还原法测定
３ 讨 论
超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是生物有机体清除超氧阴离子自由基的一个重要的保护酶．目前已经对许多生物的ＳＯＤ及其基因进行了广泛的研究，
2 结果与分析
2.1 人超氧化物歧化酶(SOD) 基因的PCR扩增结果
人超氧化物歧化酶基因(SOD)的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,结果见图1.图中M为DNAMarker;1为阴性对照;2为人SOD基因PCR产物.在约500bp处可清楚地观察到一DNA条带,与预期一致.2.2 重组大肠杆菌菌落的PCR扩增结果
重组质粒所培养的大肠杆菌菌落PCR扩增经1.2%琼脂糖凝胶电泳后结果见图2.图中M为DNAMark;1为阴性对照;2~6为菌落PCR产物.在约500bp处可在2~6孔中清晰看到所挑取菌落的菌落PCR的DNA条带,但并不排除假阳性的可能性,仍需重组质粒双酶切鉴定.
2.3 重组质粒双酶切鉴定结果
挑取菌落PCR阳性菌落培养,提取质粒后,经BamH 和SmaI联合酶切,酶切结果见图3.图中M为DNAMarker;1为未酶切重组质粒;2为重组质粒双酶切;3为PCR产物.结果表明,重组表达载体经双酶切后产生大小约为4900bp和500bp的2条DNA条带,与预期结果一致.阳性菌落送上海生工测序.2.4 重组菌经IPTG诱导表达诱导重组菌4h后超声破碎,SDS-PAGE结果见图4.图中M为蛋白质Maker;1为非重组菌未经IPTG诱导;2为非重组菌经IPTG诱导;3为重组菌未诱导;4为重组菌37 诱导4h;5为重组菌37 诱导4h超声破碎后上清;6为重组菌37 诱导4h超声破碎后沉淀.SDS-PAGE结果表明,4、5、6泳道在约45kD处出现一条非常明显的诱导蛋白条带,且其分子量与预期大小一致,而对照组(未经IPTG诱导的重组菌株)中看不到此带.说明SOD基因插入表达载体pGEX-4T-2后在大肠杆菌中获得了高效表达,且可获得分泌型表达,利于进一步纯化.
2.5 重组蛋白纯化
纯化的重组蛋白经SDS-PAGE分析,结果见图5.图中M为蛋白质Maker;1为非重组菌未经IPTG诱导;2为非重组菌经IPTG诱导;3为重组菌未诱导;4为重组菌37 诱导4h;5为纯化的SOD由图估计,经GlutathioneSepharose纯化后获得了高纯度的重组融合蛋白,重组蛋白的纯度达到了90%以上.
讨论
近年来的许多研究表明氧自由基对细胞具有许多毒副作用,特别是引起细胞DNA损伤,造成基因突变、缺失、重排与加倍,从而导致细胞程序性死亡、某些原癌基因的活化及抑癌基因的失活[10].超氧化物歧化酶SOD作为一类重要的抗氧化酶类,其临床应用特别是在疾病相关的基因治疗上的医用价值越来越受到人们的关注.有资料表明SOD基因转录活性的降低可能是导致SOD活性降低的重要原因,表明SOD在衰老过程中扮演着重要角色,具有维持线粒体的功能和发挥抗衰老的作用.同时,超氧化物歧化酶对炎症、缺血再灌注损伤、辐射损伤均有一定疗效,还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用.贺华君等的研究提出,将人CuZn-SOD靶向到中枢神经系统能够为氧自由基相关的神经性疾病,如癫痫、创伤以及与脑退化相关的帕金森病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩性侧硬化(ALS)等提供新的治疗途径.
在食品工业中,SOD可作为食品抗氧化剂,防止过氧化酶引起的食品变质及腐烂现象,或作为食品营养的强化剂,有延缓衰老的作用;在化工行业中,SOD可作为化妆品的添加剂,有抗皱、祛斑、防晒及抗炎等功效;在保健品行业,SOD还可制成药丸或药片剂型的营养补充品.
由于超氧化物歧化酶的医疗和临床应用前景,因此开展人SOD基因工程及其下游技术的研究有重要意义.本实验运用分子生物学技术从人横纹肌肉瘤（RD）细胞株细胞的cDNA中扩增出人超氧化物歧化酶(SOD)的基因,经限制性内切酶双酶切后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建融合表达载体,重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5 ,经菌落PCR、质粒双酶切及测序表明其拼接正确.IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,表明SOD基因在重组质粒上成功表达,并纯化出了目的蛋白.实验结果证明已成功构建了含pGEX-4T-2-SOD表达质粒的大肠杆菌表达菌株,且表达的融合蛋白带有GST标签,利于后期的纯化、制备多克隆抗体及ELISA免疫分析.
参考文献:
[1] 凌敏,谢科,苏上贵.人锰超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达[J].广西医科大学学报,2004,21(4):476-477.
[2] 王春花,刘克明,张明月,等.SOD基因表达与衰老的相关性[J].中国公共卫生,2004,20(8): 953-954.
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